酶底物法檢測糞便中大腸菌群的原理及操作流程

摘要：在地表水中水質環境監測糞大腸菌群具有重要的作用。而酶底物法檢測糞大腸菌群具有較準確、速度快、操作簡單等特點，是一項新的技術。

1、方法原理

在特定溫度下培養特定的時間, 糞大腸菌群能產生酶底物法采用大腸菌群細菌能產生β-半乳糖苷酶, 將選擇性培養基中的無色底物鄰硝基苯β-D-吡喃半乳甘糖分解黃色的鄰硝基苯酚, 在紫外燈照射下產生熒光。統計陽性反應出現的數量, 查MPN圖表, 在將其計算出樣品中糞大腸菌群的濃度值。其酶底物法檢出限是10MPN/L。

2、實驗室用水

實驗室用水為無菌水, 取來適量的純凈水, 放在燒杯中, 經過121攝氏度, 高壓蒸汽滅菌, 需要20分鐘。

3、采樣瓶的清洗準備

(1) 是新購買的500ml具旋帽或者是磨口塞得廣口玻璃瓶, 應在百分之二的鹽酸中浸泡幾個小時, 還需要用自來水沖洗干凈, 再用純凈水清洗1-2次, 控干, 備用。

(2) 將清洗干凈干燥的采樣器, 用專用的紙包裹起來, 放入恒溫干燥箱內, 將溫度設置到121攝氏度, 滅菌20分鐘, 烘干。滅菌完成后, 還需要關閉實驗室電源待溫度降到50攝氏度以下時, 方可開門取樣品瓶, 不然, 玻璃瓶會因為操作不當爆裂。

4、樣品的采集及保存

(1) 單獨采樣, 優先采樣。使用已經準備好的采樣瓶, 采樣。在采樣的過程中產樣瓶不用再進行沖洗。

(2) 在同一采樣點進行分層采樣時, 應自上而下進行采樣, 以免不同層次的攪擾。

(3) 水樣的保存條件及時間:水樣應在10攝氏度以下冷藏保存;應盡快分析, 最長時間不能超過6個小時。

(4) 化驗員接樣后, 不能立即檢測, 應將樣品與4攝氏度以下冷藏并在2小時內檢測。

5、分析樣品

5.1、樣品稀釋

需要根據樣品污染程度確定接種量, 避免接種樣品培養后97孔定量盤出現全部陽性或全部陰性。在接種量小于100ml的時候, 應稀釋樣品后再進行接種試驗, 接種量為10ml的時候, 取10ml樣品加入到90ml無菌水的三角瓶中混合均勻制成1:10的稀釋樣品, 其他接種量的稀釋樣品依次類推。在未知樣品, 可選用多個接種量進行檢測。

5.2、接種

量取100ml樣品或是稀釋樣品與滅菌后的三角瓶, 再加入2.7克+-0.5克培養基粉末, 在充分攪拌混勻, 等完全溶解, 在將其全部倒入97孔定量盤內, 以手扶平97孔定量盤背面, 趕出孔內氣泡, 然后, 用程控定量封口機封口。觀察97孔定量盤顏色, 若出現類似或者深于標準陽性比色盤的顏色, 則還需要進行樣品排查、培養基無菌水等一系列因素后, 終止實驗或重新實驗。

5.3、培養

測定糞大腸菌群時, 將封口后的97孔定量盤, 放入恒溫培養箱中, 在44.5攝氏度+-0.5攝氏度下, 培養24小時。

5.4、對照實驗

(1) 空白對照

每次實驗都要用無菌水按照分析步驟進行實驗室空白測定。培養后的97孔定量盤不得有任何顏色, 不然, 該實驗失敗, 應重新測定。

(2) 陽性與陰性對照

將糞大腸菌群標準菌株制成300-3000個/ml的菌懸液, 將菌懸液按接種和培養要求操作, 陽性菌株應呈現陽性反應;陰性菌株應呈現陰性反應;否則, 結果無效, 實驗失敗, 重新測定。

(3) 結果判讀及計數和有效位數的要求

將培養24小時的97孔定量盤進行結果讀數, 樣品出現變黃色判斷為糞大腸菌群陽性。測定結果保留2位有效數字。

5.5、結果計算與表示

從97孔定量盤法MPN表中查的每100ml水樣中糞大腸菌群的MPN值, 在根據樣品稀釋度不同, 按照公式換算樣品中糞大腸菌群濃度。

結語

本文通過對糞大腸菌群檢測方法酶底物法以其操作簡便、檢測周期短將在未來取代多管發酵法、濾膜法等傳統方法, 尤其是酶底物法采用密封培養技術。